На протяжении игры Дюк Нюкем встречает различных противников.

Обычные враги

• Assault Enforcer — ящероподобное существо, основная единица войск инопланетных захватчиков. Вооружен пулемётом.
• Assault Trooper
• Assault Captain
• Assault Commander — кибернетический организм, способный летать. На расстоянии атакует гранатомётом, в ближнем бою давит массой и режет ножами.
• Pig Cop — мутировавший гибрид свиньи и полицейского. Не обладает огнестрельным оружием, атакует только в рукопашную.
• Octabrain
• Octababy
• Pregnator
• Alien Fighter — небольшой атакующий летательный аппарат
• Gunship
• Dropship — вооруженный транспортный летательный аппарат
• Rat — земная крыса. В обычном состоянии причиняет небольшой урон, но если Дюк находится в уменьшенном виде крыса становится грозным врагом, способным быстро убить главного героя.
• Tentacle — враждебная инопланетная форма жизни которая обычно располагается на стенах «Улея». Атакует заострёнными щупальцами.

Боссы

• Cycloid Emperor
• Mothership
• Battlelord
• Alien Queen
• Assault Enforcer
• Octaking
• Energy Leech